基于颜色编码液滴的数字环介导等温扩增技术介绍
多重核酸检测在病原体鉴定、癌症风险等应用中具有重要价值。目前多重核酸检测常规方法是使用不同发射波长的特异性荧光探针并结合其不同的荧光强度来识别不同核酸靶标，但这面临着涉及荧光探针复杂以及综合平衡反应效率困难等问题。其它方法如荧光溶解曲线分析、图案或微球编码等在多路复用的灵活性、准确定量能力、经济效益方面需要改进。
近期，深圳大学李自达课题组基于前期开发的微孔阵列芯片（biosens.bioelectron. 2023, 220, 114913），并结合颜色编码和深度学习图像分析，实现了高通量数字化多重核酸检测。相关研究成果以“coid-lamp: color-encoded,intelligent digital lamp for multiplex nucleic acid quantification”为题发表在analytical chemistry期刊上。
在该研究中，研究团队使用基于颜色编码液滴的数字环介导等温扩增（lamp）技术，结合智能图像分析（color-encoded，intelligentdigital lamp，coid-lamp），进行多重核酸定量分析。coid-lamp通过将不同颜色的染料混入到不同的环介导等温扩增引物内，并生成微液滴，完成颜色对引物的编码，并将样本微滴化处理（图1a），然后将两种液滴分别加载到微孔阵列芯片内，使引物液滴与样本液滴一对一随机配对、融合以及环介导等温扩增（图1b）。随后，通过对液滴颜色进行分析，解码引物信息；并且利用深度学习算法模型检测液滴内的沉淀副产物，从而确定每种靶标的液滴占用率并根据泊松分布实现多种靶标的数字绝对定量。
图1 基于颜色编码液滴的数字环介导等温扩增（coid-lamp）流程示意图
为准确识别扩增后含有沉淀的阳性液滴与无沉淀的阴性液滴，研究团队利用yolov5的深度学习算法开发了一个液滴检测模型，并验证了该检测模型的准确性能（平均精度均值为0.97）。
图2 深度学习模型结构与分析性能展示
在构建深度学习液滴检测模型后，研究团队表征了coid-lamp进行数字核酸扩增检测的分析性能。对不同浓度的单一核酸靶标按照coid-lamp方法进行了检测（除引物类型仅有一种外，其余按照coid-lamp方案执行）。液滴检测模型准确地识别了阳性与阴性液滴，在已知浓度为1.27 × 10² ~ 1.27 × 10⁴ copies/µl时，coid-lamp的检测结果与已知浓度具有良好的一致性。通过对该范围内数据线性拟合，得到coid-lamp检测值与实际值之间的关系，r²为0.9986，这表明了coid-lamp具有优秀的核酸定量能力。
图3 coid-lamp在核酸定量中的性能表征
为了验证coid-lamp的多路复用能力，研究团队首先使用了生物医学应用广泛的荧光染料作为液滴编码材料，通过3种激发波长的荧光染料对8种引物液滴进行了编码，建立了8重核酸分析策略。首先利用lamp的高度特异性去验证了荧光染料进行液滴编码-解码的准确性，即通过已知的染料去编码引物液滴，并与单一核酸靶标液滴进行配对、融合、扩增，扩增后的lamp阳性液滴其对应的荧光编码是唯一的，且与该靶标对应的引物荧光编码保持一致。
图4 使用荧光染料进行液滴编码和解码准确性的验证
在验证了荧光染料进行液滴编码与解码的准确性后，研究团队根据coid-lamp的数字定量范围，预设了已知浓度的多靶标核酸样本，并按照coid-lamp方案进行了多靶标定量分析，结果显示，检测浓度与已知浓度具有良好的一致性。
图5 使用荧光染料编码进行多种核酸分析
为进一步降低对检测设备的需求，研究团队使用了明场的彩色染料作为液滴编码材料，通过3种染料对4种引物液滴编码，建立了4重核酸分析策略。同样地，验证了明场染料进行液滴编码-解码的准确性。
图6 使用彩色染料的液滴编码和解码准确性的验证
最后，研究团队预设了已知浓度的4重靶标核酸样本，使用3种染料对4种引物液滴编码，按照coid-lamp方案进行了多靶标定量分析，结果证明了基于明场染料的coid-lamp核酸定量的准确性。
图7 使用彩色染料对液滴编码进行多重核酸分析
综上所述，该研究开发的coid-lamp技术具有检测成本低、操作简单、对仪器要求低的优势，为开发适用于poct的多重核酸检测系统提供了新的解决方案。
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在该研究中，研究团队使用基于颜色编码液滴的数字环介导等温扩增（lamp）技术，结合智能图像分析（color-encoded，intelligentdigital lamp，coid-lamp），进行多重核酸定量分析。coid-lamp通过将不同颜色的染料混入到不同的环介导等温扩增引物内，并生成微液滴，完成颜色对引物的编码，并将样本微滴化处理（图1a），然后将两种液滴分别加载到微孔阵列芯片内，使引物液滴与样本液滴一对一随机配对、融合以及环介导等温扩增（图1b）。随后，通过对液滴颜色进行分析，解码引物信息；并且利用深度学习算法模型检测液滴内的沉淀副产物，从而确定每种靶标的液滴占用率并根据泊松分布实现多种靶标的数字绝对定量。
图1 基于颜色编码液滴的数字环介导等温扩增（coid-lamp）流程示意图
为准确识别扩增后含有沉淀的阳性液滴与无沉淀的阴性液滴，研究团队利用yolov5的深度学习算法开发了一个液滴检测模型，并验证了该检测模型的准确性能（平均精度均值为0.97）。
图2 深度学习模型结构与分析性能展示
在构建深度学习液滴检测模型后，研究团队表征了coid-lamp进行数字核酸扩增检测的分析性能。对不同浓度的单一核酸靶标按照coid-lamp方法进行了检测（除引物类型仅有一种外，其余按照coid-lamp方案执行）。液滴检测模型准确地识别了阳性与阴性液滴，在已知浓度为1.27 × 10² ~ 1.27 × 10⁴ copies/µl时，coid-lamp的检测结果与已知浓度具有良好的一致性。通过对该范围内数据线性拟合，得到coid-lamp检测值与实际值之间的关系，r²为0.9986，这表明了coid-lamp具有优秀的核酸定量能力。
图3 coid-lamp在核酸定量中的性能表征
为了验证coid-lamp的多路复用能力，研究团队首先使用了生物医学应用广泛的荧光染料作为液滴编码材料，通过3种激发波长的荧光染料对8种引物液滴进行了编码，建立了8重核酸分析策略。首先利用lamp的高度特异性去验证了荧光染料进行液滴编码-解码的准确性，即通过已知的染料去编码引物液滴，并与单一核酸靶标液滴进行配对、融合、扩增，扩增后的lamp阳性液滴其对应的荧光编码是唯一的，且与该靶标对应的引物荧光编码保持一致。
图4 使用荧光染料进行液滴编码和解码准确性的验证
在验证了荧光染料进行液滴编码与解码的准确性后，研究团队根据coid-lamp的数字定量范围，预设了已知浓度的多靶标核酸样本，并按照coid-lamp方案进行了多靶标定量分析，结果显示，检测浓度与已知浓度具有良好的一致性。
图5 使用荧光染料编码进行多种核酸分析
为进一步降低对检测设备的需求，研究团队使用了明场的彩色染料作为液滴编码材料，通过3种染料对4种引物液滴编码，建立了4重核酸分析策略。同样地，验证了明场染料进行液滴编码-解码的准确性。
图6 使用彩色染料的液滴编码和解码准确性的验证
最后，研究团队预设了已知浓度的4重靶标核酸样本，使用3种染料对4种引物液滴编码，按照coid-lamp方案进行了多靶标定量分析，结果证明了基于明场染料的coid-lamp核酸定量的准确性。
图7 使用彩色染料对液滴编码进行多重核酸分析
综上所述，该研究开发的coid-lamp技术具有检测成本低、操作简单、对仪器要求低的优势，为开发适用于poct的多重核酸检测系统提供了新的解决方案。
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