新墨西哥州立大学：时间分辨流式细胞术
“obis激光器支持我们工作所需的快速直接数字调制，而且添加和移除这些即插即用激光器非常容易，它们都具有相同的形式和适用性。它们提供了丰富的数据。”--jessica houston，美国新墨西哥州拉斯克鲁塞斯市新墨西哥州立大学化学与材料工程系教授。
挑战
新墨西哥州立大学jessica houston教授的研究小组研究了在流式细胞术中使用时间分辨测量的独特方法。该小组关注的一个重要领域是在化疗药物存在的情况下，使用荧光寿命测量法对癌症细胞进行代谢图谱绘制，评估其活力。另一个关键应用靶向基本细胞信号传导和受体活性，使用förster(荧光)共振能量转移(fret)和荧光蛋白。
houston指出，时间分辨流式细胞术与大多数现有的流式细胞仪应用程序明显不同，后者依赖稳态荧光强度数据来执行计数和分选功能。商业上可买到的针对稳态数据优化的流式细胞仪不适合她的研究。因此，作为第一步，她的团队必须建立自己的流式细胞仪。
有两种众所周知的测量荧光寿命的方法：在时域中使用脉冲激光或其他光源，或者在频域中。houston解释说，“我们需要一台高通量流式细胞仪来对大量细胞进行无损计数和/或分类，例如，用于研究血液中的转移性癌症细胞。而使用光子计数的时域测量无法支持必要的吞吐量。因此，我们决定在频域工作，在频域中，既定的方法是对细胞的兴奋性在激光上，并关联调制荧光发射中观察到的相移。”
图1时间分辨流式细胞仪的关键元件
图2组装时间分辨流式细胞仪
解决方案
休斯顿小组希望在他们的工作中除了研究nadh和fad等代谢物的内源性荧光外，还能够使用许多不同的荧光团。因此，他们需要多种激光波长来有效地激发所有这些不同的目标。他们还需要在光束指向和功率噪声方面具有良好模式质量(即低m2)以及高稳定性输出的激光器。
经过仔细评估，他们决定使用coherent的obis激光器。houston指出：“我们目前有几种波长包括375 nm、405 nm、488 nm和633 nm的obis激光器。这些智能激光器非常适合我们的工作。除了高质量的输出外，它们还支持我们工作所需的快速直接数字调制，加上添加和移除这些形状和尺寸相同的即插即用激光器非常容易。”。“她指出，10瓦甚至100瓦的可用性是obis的另一个重要功能。这是因为她的许多实验都是基于频域寿命测量的，其中数字调制基本上将流动池的激光功率降低了50%
结果
休斯顿表示，她定制的流式细胞仪和越来越多的obis激光已被证明是一个成功的组合，并已为她的代谢谱研究和fret工作提供了大量数据。
对于代谢谱，她引用了nadh的例子，其中测量的荧光寿命取决于该代谢物在被评估的细胞中主要处于结合状态还是未结合状态。这与细胞如何产生atp有关，atp是一种为大多数细胞活动提供能量的分子。正常细胞的代谢活性主要依赖线粒体氧化磷酸化(oxphos)来产生atp。但在许多类型的癌细胞中，糖酵解在atp的产生中发挥着更大的作用，oxphos的能力降低。因此，休斯顿研究小组可以使用nadh寿命作为细胞对新治疗反应的定量指标。
该小组还使用该系统快速获取定量fret数据。他们正在分析这些数据，以更好地了解蛋白质-蛋白质的相互作用，进行蛋白质构象研究，并探索酶的作用。休斯顿指出，“我们可以观察供体荧光团是否处于猝灭状态。我们还可以捕捉供体发射和受体发射。同样，这些数据可以表明癌症治疗的有效性。总而言之，obis激光器和我们的高通量细胞仪确实提供了丰富的数据。”
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houston指出，时间分辨流式细胞术与大多数现有的流式细胞仪应用程序明显不同，后者依赖稳态荧光强度数据来执行计数和分选功能。商业上可买到的针对稳态数据优化的流式细胞仪不适合她的研究。因此，作为第一步，她的团队必须建立自己的流式细胞仪。
有两种众所周知的测量荧光寿命的方法：在时域中使用脉冲激光或其他光源，或者在频域中。houston解释说，“我们需要一台高通量流式细胞仪来对大量细胞进行无损计数和/或分类，例如，用于研究血液中的转移性癌症细胞。而使用光子计数的时域测量无法支持必要的吞吐量。因此，我们决定在频域工作，在频域中，既定的方法是对细胞的兴奋性在激光上，并关联调制荧光发射中观察到的相移。”
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休斯顿小组希望在他们的工作中除了研究nadh和fad等代谢物的内源性荧光外，还能够使用许多不同的荧光团。因此，他们需要多种激光波长来有效地激发所有这些不同的目标。他们还需要在光束指向和功率噪声方面具有良好模式质量(即低m2)以及高稳定性输出的激光器。
经过仔细评估，他们决定使用coherent的obis激光器。houston指出：“我们目前有几种波长包括375 nm、405 nm、488 nm和633 nm的obis激光器。这些智能激光器非常适合我们的工作。除了高质量的输出外，它们还支持我们工作所需的快速直接数字调制，加上添加和移除这些形状和尺寸相同的即插即用激光器非常容易。”。“她指出，10瓦甚至100瓦的可用性是obis的另一个重要功能。这是因为她的许多实验都是基于频域寿命测量的，其中数字调制基本上将流动池的激光功率降低了50%
结果
休斯顿表示，她定制的流式细胞仪和越来越多的obis激光已被证明是一个成功的组合，并已为她的代谢谱研究和fret工作提供了大量数据。
对于代谢谱，她引用了nadh的例子，其中测量的荧光寿命取决于该代谢物在被评估的细胞中主要处于结合状态还是未结合状态。这与细胞如何产生atp有关，atp是一种为大多数细胞活动提供能量的分子。正常细胞的代谢活性主要依赖线粒体氧化磷酸化(oxphos)来产生atp。但在许多类型的癌细胞中，糖酵解在atp的产生中发挥着更大的作用，oxphos的能力降低。因此，休斯顿研究小组可以使用nadh寿命作为细胞对新治疗反应的定量指标。
该小组还使用该系统快速获取定量fret数据。他们正在分析这些数据，以更好地了解蛋白质-蛋白质的相互作用，进行蛋白质构象研究，并探索酶的作用。休斯顿指出，“我们可以观察供体荧光团是否处于猝灭状态。我们还可以捕捉供体发射和受体发射。同样，这些数据可以表明癌症治疗的有效性。总而言之，obis激光器和我们的高通量细胞仪确实提供了丰富的数据。”
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