科学家开发了一种能够区分单分子核酸和单细胞差异的方法
科学家开发了一种能够区分单分子核酸和单细胞差异的方法，即将含有核酸或细胞的水相通过特殊设计的微流控芯片注入到油相中，生成大小一致的微米级液滴，使单个核酸或细胞从群体中分离并包裹在微滴中，进而研究单分子或单细胞之间的差异。对每个微滴进行连续不断的观测将会有助于人们理解单分子反应动力学的变化和细胞行为的不同。
将粒径均匀的水相微滴分散到连续的油相中是违反热力学平衡的。微滴会不断地融合形成大的液滴，直至水油两相发生分层，在油相中加入表面活性剂（abil em 90、pfpe-peg、span 80）可以延缓液滴融合，但不能消除这一现象。因此在长期的单细胞培养中人们依然可以观察到微滴融合，并且这一现象在温度剧烈变化的数字聚合酶链式反应（digital pcr）中更加明显（图1）。数字pcr中液滴融合会影响定量的准确性并造成稀有样品的浪费。此外，液体的流动性使对单个微滴进行跟踪观察变得十分困难。近日，浙江大学牟颖教授团队研发出一种热凝固的油相物质能够解决液滴融合和液滴流动的问题，实现了对单个液滴的实时监控。
图1. 液滴数字pcr反应后液滴融合
牟颖教授团队研发的这种热凝固材料由低粘度的甲基硅油、乙烯基硅油、含氢硅油、非离子表面活性剂和铂催化剂组成。这种新型的油相能够在铂催化下通过乙烯基硅油和含氢硅油发生硅氢化反应自发凝固，不需要紫外或带点离子等外界条件触发。油相中表面活性剂的作用是生成粒径均一的液滴和在油凝固之前稳定液滴。在凝固前，该油相可用来生成多种类型的液滴：（a）水包油(o/w)、（b）油包水(w/o)、（c）水包油包水(w/o/w)和（d）双核乳滴（图2）。
图2. 可凝固油相生成的多种类型液滴
这种可凝固材料的固化速度与温度有关。在细胞培养温度下（37℃），该油相可在70 min内凝固，而在pcr反应中95 ℃预变性时，该材料凝固仅需要37 s。在上述条件下，油相由液态变为固态，液滴也被“冻结”，失去流动性。相邻液滴间的液态隔膜变为固态隔膜，液滴被固体包裹使液滴无法融合。当液滴中的水分蒸发以后，液滴所在位置变成一个个空泡（图3a）。将芯片纵切后可看到，相邻的液滴空腔被固态的隔膜分开（图3b）。
图3. 凝固后的油相中液滴蒸发后形成的空泡
同时，这种热凝固的油相也具有很好的生物相容性。他们利用该油相物质生成的液滴进行液滴数字pcr（ddpcr）和单细胞培养时，实现了对pcr反应和细胞生长过程的实时监控，并且对pcr反应和细胞生长没有影响（图4）。阳性微滴的荧光强度随着pcr反应循环数的增加逐渐增强（图4a）。单个细胞在液滴内培养时，分别在48 h和120 h观察到了细胞分裂（图4b）。
图4．可凝固油相中pcr反应和细胞生长过程的实时监控
此外，数字pcr反应产物也可以从这种可凝固油形成的微囊中完全回收，用于进一步的分析研究，例如测序。
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图1. 液滴数字pcr反应后液滴融合
牟颖教授团队研发的这种热凝固材料由低粘度的甲基硅油、乙烯基硅油、含氢硅油、非离子表面活性剂和铂催化剂组成。这种新型的油相能够在铂催化下通过乙烯基硅油和含氢硅油发生硅氢化反应自发凝固，不需要紫外或带点离子等外界条件触发。油相中表面活性剂的作用是生成粒径均一的液滴和在油凝固之前稳定液滴。在凝固前，该油相可用来生成多种类型的液滴：（a）水包油(o/w)、（b）油包水(w/o)、（c）水包油包水(w/o/w)和（d）双核乳滴（图2）。
图2. 可凝固油相生成的多种类型液滴
这种可凝固材料的固化速度与温度有关。在细胞培养温度下（37℃），该油相可在70 min内凝固，而在pcr反应中95 ℃预变性时，该材料凝固仅需要37 s。在上述条件下，油相由液态变为固态，液滴也被“冻结”，失去流动性。相邻液滴间的液态隔膜变为固态隔膜，液滴被固体包裹使液滴无法融合。当液滴中的水分蒸发以后，液滴所在位置变成一个个空泡（图3a）。将芯片纵切后可看到，相邻的液滴空腔被固态的隔膜分开（图3b）。
图3. 凝固后的油相中液滴蒸发后形成的空泡
同时，这种热凝固的油相也具有很好的生物相容性。他们利用该油相物质生成的液滴进行液滴数字pcr（ddpcr）和单细胞培养时，实现了对pcr反应和细胞生长过程的实时监控，并且对pcr反应和细胞生长没有影响（图4）。阳性微滴的荧光强度随着pcr反应循环数的增加逐渐增强（图4a）。单个细胞在液滴内培养时，分别在48 h和120 h观察到了细胞分裂（图4b）。
图4．可凝固油相中pcr反应和细胞生长过程的实时监控
此外，数字pcr反应产物也可以从这种可凝固油形成的微囊中完全回收，用于进一步的分析研究，例如测序。
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